Исследование агрегационной способности тромбоцитов

В неповреждённом сосуде тромбоциты не взаимодействуют друг с другом и не адгезируют за счёт электростатического отталкивания от эндотелия. Реакция тромбоцитов на внешние стимулы зависит от соотношения внеклеточных сигналов, активирующих и ингибирующих активность клеток. Мембрана тромбоцитов содержит рецепторы для многих индукторов их активации и ингибиторов. На мембране тромбоцитов человека выявлено около 30 участков рецепторного связывания биологически активных соединений разнообразной химической природы.

Физиологические стимуляторы активности тромбоцитов можно разделить на две группы: слабые (АДФ в концентрации менее 1 мкМ, вазопрессин, адреналин, серотонин) и сильные (тромбин, коллаген, тромбоксан А₂, фактор активации тромбоцитов) агонисты. К антагонистам относят простагландин I₂ (простациклин), простагландин D₂, NO (окись азота, эндотелиальный релаксирующий фактор) . В месте образования сосудистого дефекта ( в результате механического повреждения, воздействия химического вещества, изъязвления атеросклеротической бляшки) экспонируются молекулы адгезии (адгезивные белки служат "центрами притяжения" циркулирующих в крови тромбоцитов) эндотелиального происхождения: фибронектин, ламинин, фактор Виллебранда, витронектин и др. Так, взаимодействие фактора фон Виллебранда с тромбоцитами опосредовано гликопротеиновыми комплексами Ia и Ib. Фактор Виллебранда представляет собой гликопротеин массой 10⁶ Да. Его синтезируют васкулярные эндотелиальные клетки, а также в небольшом количестве он присутствует в тромбоцитах и плазме крови.

Уменьшение концентрации этого фактора и его функциональная пассивность вызывают нарушение адгезии тромбоцитов к субэндотелию и увеличение времени кровотечения. При ишемической болезни сердца, атеросклерозе, сахарном диабете увеличивается адгезивность. Механизм этого процесса пока не известен.

Полагают, что важную роль в этом случае может играть недостаточное образование простациклина.

В зависимости от степени выраженности тромбоцитарные ответы можно разделить на три типа.

• Первый тип - обратимый ответ, включающий первые три стадии активации. Он реализуется при действии слабых агонистов. В этом случае полная активация не обеспечивается, тромбоцитарный агрегат распадается, тромбоциты могут вернуться в своё пер во начальное дисковидное состояние.

• Второй тип - необратимый ответ тромбоцитов на действие сильных агонистов, при нём происходят выброс содержимого α-гранул, плотных гранул и необратимая агрегация.

• Третий тип - реакция дезагрегации, индуцируемая антагонистами.

Фиксация тромбоцита к повреждённым структурам сосуда создаёт предпосылки для эффективного взаимодействия тромбоцита с главным белком соединительной ткани - коллагеном. Последовательность биохимических процессов, лежащих в основе индуцированной коллагеном активации тромбоцита, условно можно разделить на пять последовательных биохимических стадий.

I стадия

Инициация активации тромбоцитарного звена гемостаза обусловлена образованием комплекса коллагена со специфическим мембранным рецептором коллагена.

Результатом этого взаимодействия становится активация мембраносвязанного фермента фосфолипазы А₂ с образованием двух продуктов - арахидоновой кислоты и лизоформа (предшественник) фактора активации тромбоцитов. Субстратом этой реакции служит молекула фосфолипида, содержащего во втором положении глицеринового остатка арахидоновую кислоту. Чаще всего в качестве субстрата выступает молекула фосфатидилхолина, преимущественно содержащегося во внешнем слое наружной плазматической мембраны тромбоцита: на его долю приходится приблизительно 26% общего содержания липидов в плазматической мембране.

Под действием фермента циклооксигеназы арахидоновая кислота быстро конвертируется в циклические эндоперекиси - простагландин G₂ и простагландин Н₂ - короткоживущие высокореакционные соединения, которые по механизму отрицательной обратной связи ингибируют активность циклооксигеназы. Продукт реакции, катализируемой ферментом тромбоксансинтетазой, - тромбоксан А₂ - мощный индуктор агрегации и вазоконстриктор. Другой сильный индуктор агрегации - фактор активации тромбоцитов. Он образуется из своего предшественника путём ферментативного ацетилирования с помощью ацетилтрансферазы.

Таким образом, в ходе первой стадии активации тромбоцитов образуются два активных стимулятора, при этом их конечные внутриклеточные концентрации значительно превышают количество активных "сайтов" коллагена. Основные принципы каскадного механизма активации тромбоцитов - усиление активирующего сигнала и его конвергенция - находят отражение и в последующих стадиях активации. Следует отметить, что 1 этап агрегации обычно не сопровождается заметными изменениями формы и адгезивных способностей тромбоцитов.

Терминация стимулирующего сигнала тромбоксана А₂ и фактора активации тромбоцитов осуществляется ферментами их метаболизма, максимальное содержание которых обнаружено в лёгких. В результате быстрой инактивации период полужизни эйкозаноидов не превышает 1 мин.

Чтобы произошла агрегация тромбоцитов, помимо их активации агонистамииндукторами агрегации необходимо наличие ионов Са²⁺, так как агрегация тромбоцитов связана с внутриклеточным обменом Са²⁺ (мобилизация кальция из плотной тубулярной системы в цитоплазму).

К фармакологическим соединениям, ингибирующим данную стадию активации тромбоцитов и широко используемым в неврологической практике, относят ингибиторы циклооксигеназы. В зависимости от механизма действия их делят на препараты необратимого типа действия (ацетилсалициловая кислота) и обратимые ингибиторы циклооксигеназы. Приём 500 мг ацетилсалициловой кислоты приводит к инактивации циклооксигеназы всех циркулирующих тромбоцитов крови. Поскольку отсутствие ядра не позволяет тромбоцитам ресинтезировать новый фермент, они теряют способность продуцировать эйкозаноиды, прежде всего тромбоксан А₂. Ацетилсалициловая кислота также угнетает активность циклооксигеназы эндотелиальных клеток, но они способны регенерировать новый фермент в течение нескольких часов. Поэтому идеальная терапия ацетилсалициловой кислотой предполагает использование низких доз, при этом ингибируется синтез тромбоксана А₂ в тромбоцитах и быстро восстанавливается синтез простагландина I₂ в эндотелии. Этому условию соответствует приём ацетилсалициловой кислоты из расчёта 1 мг/кг/сут. Свойством обратимо ингибировать тромбоцитарную циклооксигеназу обладают такие НПВС, как фенилбутазон, индометацин, индобуфен, напроксен.

2 стадия

Ауто- и паракринный механизм активации тромбоцитов под действием фактора активации тромбоцитов и тромбоксана А₂ опосредован специфическими мембранными рецепторами и определяется стимуляцией активности мембраносвязанного фермента фосфолипазы С. Результатом ферментативного гидролиза минорного фосфолипида фосфатидилинозитолдифосфата становится образование двух соединений - l,4,5-инозитолтрифосфата и диацилглицерина, обладающих свойствами вторичных внутриклеточных посредников. 1,4,5-инозитолтрифосфат -гидрофильное соединение, мобилизующее ионизированный Са²⁺ из его внутриклеточных депо (плотной тубулярной системы и других структурных образований эндоплазматического ретикулума тромбоцитов). Молекулярной мишенью действия диацилглицерина служит мультифункциональный мембраносвязанный фермент протеинкиназа С, осуществляющий фосфорилирование различных внутриклеточных белков по сериновым и треониновым остаткам. Регуляторная роль протеинкиназы С сводится к запуску внутриклеточных механизмов снижения концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме тромбоцита . .эти механизмы включают фосфорилирование и последующее ингибирование активности рецептор-управляемых кальциевых каналов плазматической мембраны.

Примером отрицательной обратной связи служит активация под действием протеинкиназы С фермента 3-фосфомоноэстеразы, участвующего в метаболизме 1,4,5-инозитолтрифосфата до инозитолдифосфата.

Таким образом, ключевое звено 2 этапа активации тромбоцитов - мобилизация ионов кальция из внутриклеточных депо. Ионизированный кальций - основной регулятор последовательности тромбоцитарной активации.

Фармакологическая регуляция активности тромбоцитов на данном этапе включает воздействие на рецепторы фактора активации тромбоцитов, тромбоксана А₂ и внутриклеточный обмен ионов кальция. Антагонисты рецепторов тромбоксана А₂ - (з-пиридинил)алканоевые и (арилсульфониламино)алканоевые кислоты.

Проведённые клинические испытания продемонстрировали эффективность этих классов соединений in vivo при ангиопластике, сахарном диабете, беременности, артериальной гипертензии, кардио- и цереброваскулярных заболеваниях, сопровождающихся увеличением синтеза тромбоксана.

3 стадия

К основным внутриклеточным процессам, находящимся под контролем внутриклеточного содержания кальция, относят следующие.

• Положительная модуляция активности мембранных фосфолипаз А₂ и С.

• Экспрессия на поверхности клетки гликопротеиновых рецепторов фибриногена и интегриновых комплексов (экспозиция некоторых факторов адгезии не является Са-зависимым процессом) .

• Ингибирование аденилатциклазного и гуанилатциклазного путей, тормозящих стимуляцию тромбоцитов.

• Работа сократительного аппарата тромбоцитов, обусловливающая изменение формы тромбоцита, адгезивную активность, секрецию и высвобождение содержимого внутриклеточных гранул.

Чтобы проявилось влияние Са²⁺ на большинство из перечисленных процессов, необходимо предварительное образование комплекса четырёх ионов кальция с кальмодулином - специфическим кальцийсвязывающим белком, относящимся к семейству S-1О0-белков. Образованный комплекс (Са-кальмодулин) обладает способностью активировать киназу лёгких цепей миозина, стимулируя секрецию и дегрануляцию. Другие мишени действия комплекса Са-кальмодулин - аденилатциклаза и гуанилатциклаза. Их фосфорилирование Са-кальмодулинзависимыми протеинкиназами вызывает снижение их ферментативной активности и последующее уменьшение внутриклеточного содержания циклических нуклеотидов - цАМФ и цГМФ соответственно. Взаимодействие комплекса Са-кальмодулин с фосфодиэстеразой цАМФ, напротив, вызывает стимуляцию активности этого фермента и, как следствие, ускоренный метаболизм цАМФ до неактивного АМФ.

Антагонисты кальмоцулина - производные l,4-дигидропиридина, фенотиазина (трифтазин) - вызывают конформационные изменения в молекуле кальмодулина, нарушая его способность связывать кальций. Угнетение функциональной активности тромбоцитов у этих соединений соответствует степени сродства к кальмодулину.

3 стадия соответствует фазе первичной (обратимой) агрегации тромбоцитов.

Возможность перехода тромбоцитов из III в IV стадию активации определяется как внутриклеточными механизмами регуляции, снижающими концентрацию свободных ионов кальция в цитоплазме тромбоцита, так и тормозными экстраклеточными стимулами, действие которых реализуется через аденилатциклазную и гуанилатциклазную систему трансдукции сигнала. Если рассматривать экстраклеточный уровень, то решающее значение здесь имеют простациклин и NO.

В тромбоцитах эту тормозящую роль играют цАМФ и цГМФ.

Клетки эндотелия постоянно выделяют простациклин в кровоток. Связываясь со специфическими рецепторами на мембране тромбоцитов, он активирует aдeнилатциклазу, повышает внутриклеточное содержание цАМФ и снижает концентрацию ионов кальция. Синтез простациклина в клетках эндотелия включает те же реакции, что и синтез тромбоксана А₂ в тромбоцитах. Отличие проявляется в заключительной стадии синтеза, когда под действием простациклинсинтетазы простагландин Н2 превращается в простагландин I₂.

Гуанилатциклаза катализирует переход ГТФ в цГМФ. Увеличение внутриклеточного содержания цГМФ ингибирует последующие тромбоцитарные ответы через угнетение активности фосфолипида С. Указанный путь торможения агонистиндуцированного ответа тромбоцитов характерен для NO, который вызывает селективную активацию гуанилатциклазы, связываясь с гемовой группировкой этого фермента. NО-синтетаза присутствует в различных клетках, включая макрофаги, нейтрофилы, эндотелиальные клетки, тромбоциты. Этот фермент: используя L-аргинин как субстрат, генерирует NO и L-цитрулин В качестве метаболита. Метиловый эфир L-аргинина - специфический ингибитор NО-синтетазы. Основной путь уменьшения концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме тромбоцита - активация Ca-АТФаз плотной тубулярной системы и плазматической мембраны, уменьшающих внутриклеточное содержание кальция за счёт его обратного захвата во внутриклеточные депо (ресеквестрация) и выброса Са²⁺ из клетки. Кальцийблокирующий эффект циклических нуклеотидов опосредован специфическими цАМФ- и цГМФ-зависимыми протеинкиназами. В то же время не исключено, что часть эффектов циклических нуклеотидов обусловлена их прямым воздействием на активность протеинкиназы С, фосфолипазы С и А₂. Стимуляторы аденилатциклазы и гуанилатциклазы ведут к быстрому снижению концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме тромбоцита, они способны блокировать активацию тромбоцитов в любой её стадии. Напротив, способность адреналина вызывать агрегацию тромбоцитов обусловлена снижением активности аденилатциклазы, опосредованным α₁-адренорецепторами.

• Активаторы аденилатциклазы - стабильный аналог простациклина эпопростенол^Р, аденозин, простагландины Е₁ и D₂

• Дипиридамол по механизму действия относят к конкурентным блокаторам захвата аденозина различными типами клеток, он пролонгирует антиагрегантное действие аденозина.

• Активаторы гуанилатциклазы - органические нитраты и нитросодержащие препараты, такие как нитроглицерин, изосорбида мононитрат, нитропруссид натрия, молсидомин. Этот класс соединений успешно используют при кардиоваскулярных расстройствах, но концентрации этих препаратов, в которых они способны ингибировать активность тромбоцитов, значительно выше терапевтических. Их положительный эффект, скорее всего, обусловлен вазодилатацией.

Другой путь повышения содержания цАМФ - подавление активности фосфодиэстеразы цАМФ. К ингибиторам этого фермента относят производные ксантина - пентоксифиллин, кофеин, теофиллин.

4 стадия

4 стадия - стадия дегрануляции. В ходе реакции высвобождения из тромбоцитов через открытую канальцевую систему выделяются АДФ, фактор активации тромбоцитов, вазопрессин, серотонин, адреналин, тромбоксан A₂, вовлекающие в процесс агрегации другие тромбоциты. Тромбоксан A₂ и серотонин (посредством активации 5-НТ_2a -рецепторов) , обладая вазоконстрикторным действием, обусловливают скопление тромбоцитов в месте повреждения, локализуя процесс. Важный процесс для развития необратимой агрегации - высвобождение во внеклеточное пространство АДФ. Мембранные рецепторы АДФ относят к классу Р_2x-пуриновых рецепторов, одновременно они служат Са-каналами. Активация этих рецепторов вызывает вход в клетку внеклеточного Ca²⁺ по градиенту концентрации.

К фармакологическим соединениям, ингибирующим данную стадию активации тромбоцитов, относят:

• препараты, вызывающие деструкцию сократительного аппарата, - винкристин, колхицин;

• блокаторы кальциевых каналов - верапамил, нифедипин, дилтиазем.

5 стадия

Конечные этапы активации тромбоцитов связаны с экспозицией рецепторов фибриногена - гликопротеинового комплекса IIb- IПа на поверхности тромбоцитов.

Препараты тиклопидин и клопидогрел ингибируют экспрессию гликопротеиновых комплексов Пb-IПа и блокируют трансформацию этого комплекса в высокоаффинный лигандсвязывающий сайт. Действие этих препаратов длительное, максимальный эффект наступает через 3-7 дней.

Следует отметить, что каскадная система включения и активации факторов, регулирующих внутриклеточную концентрацию ионов кальция - основного индикатора активности тромбоцитов, отличается надёжностью и динамичностью.

Для неё характерны множественность путей про ведения сигнала, дублирование и взаимозаменяемость элементов, быстрый возврат к равновесному состоянию.

Этим обусловлена сложность адекватного фармакологического вмешательства в работу каскадной системы активации тромбоцитов.

Исследование агрегационной способности тромбоцитов целесообразно про водить до И во время антиагрегантной терапии, чтобы подобрать адекватную дозу антиагреганта и контролировать эффективность антитромботической терапии.

Интерпретация результатов исследования агрегационной способности тромбоцитов кратко резюмирована в табл. 2-6.

Таблица 2-6. Оценка результатов анализа агрегационной способности тромбоцитов