Иммунологическое исследование крови

Ухудшение экологической обстановки и социальноэкономические условия, сопровождающиеся длительной стрессовой ситуацией, приводят к снижению иммунореактивности населения, увеличению частоты развития вторичных иммунодефицитных состояний. Снижение pезистентности организма, употребление ЛС с иммунодепpессиpующим эффектом, pецидивиpующая хроническая вирусная инфекция способствуют развитию вялотекущих воспалительных и дистpофических процессов в половых органах женщины. Нарушения в иммунной системе — важное звено в патогенезе эндометриоза, а также в возникновении и пролиферации новообразований у женщин с бесплодием неясного генеза, наличием антиспеpмальных АТ, АФС, острыми и хроническими воспалительными заболеваниями.

Местные и системные изменения иммунитета можно выявить при иммунологическом исследовании крови с использованием основных традиционных и современных методов. Иммунологические методы необходимы для создания новых диагностических и лечебных технологий, включающих патогенетически обоснованную индивидуально подобранную иммунотерапию с учётом особенностей иммунной системы конкретного пациента. Своевременная правильная диагностика иммунологических нарушений, позволяющая провести их коррекцию, позволяет снизить дозы и длительность применения антибиотиков, предупредить возникновение аллергических реакций.

Основные параметры иммунного статуса (табл. 6-3, табл. 6-4) — количество и активность циркулирующих лимфоцитов, естественных киллеров и фагоцитирующих клеток, концентрация сывороточных иммуноглобулинов, содержание специфических АТ. Иммунологические методы позволяют охарактеризовать тот иммунологический фон, на котором развивается большинство гинекологических и акушерских заболеваний, и позволяет контролировать эффективность лечения, в первую очередь иммуномодулирующими препаратами.

Таблица 6-3. Основные показатели иммунного статуса

Показатель	Относительное содержание, %	Содержание в литре, 109 кл/л
Лейкоциты	100	4,5–9,5
Лимфоциты	18–39	1,6–2,4
CD3+ (Т-лимфоциты)	56–75	1,0–1,6
CD4+ (Т-хелперы)	34–48	0,6–1,2
CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты)	19–30	0,3–0,7
CD4+/CD8+		1,5–2,6
CD16+ (NK-клетки)	8–19	0,2–0,4
CD56+ (NK-клетки)	5–18
CD3–CD56,16+	4–16
CD3+CD56,16+	1–16
CD19+ (В-лимфоциты)	5–10
CD5+CD19+ (Bl-лимфоциты)	1–2,0
CD95+	27–55
CD4+CD25+ (активированные Т-лимфоциты)	1,8–7,5

Таблица 6-4. Основные показатели иммунного статуса

Иммуноглобулины		Интерфероновый статус
Показатель	Содержание в литре, г/л	Показатель	Ед/мл
IgM	0,5–2,0	Сывороточный интерферон (ИФН)	<4
IgG	8,0–16,0	ИФН-a	32–256
IgA	0,7–3,0	ИФН-y	16–64

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

СИНОНИМЫ

Субпопуляционный анализ лимфоцитов крови, фенотипическая характеристика лимфоцитов.

ОБОСНОВАНИЕ

Подразделение лимфоцитов человека на Тлимфоциты, Влимфоциты и естественные киллеры основано на их биологических функциях и на экспрессии ими поверхностных клеточных Аг, определение уровня которой называется фенотипированием. В основе метода лежит связывание флюоресцентно меченых моноклональных АТ поверхностными Аг лимфоцитов и учёт результатов с помощью проточного лазерного цитометра или люминесцентной микроскопии.

ЦЕЛЬ

Подсчёт клеток определённой популяции, или спектра Аг, экспрессированных на данных клетках.

ПОКАЗАНИЯ

Метод используют для количественной и качественной характеристики субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови при наличии или подозрении на наличие иммунодефицитных состояний, развившихся на фоне воспалительных, гиперпластических и других процессов в органах женской репродуктивной системы.

ПОДГОТОВКА

Из вены пациентки берут кровь в пробирку с гепарином (20 Ед/мл).

МЕТОДИКА

Кровь обрабатывают лизирующим раствором для разрушения эритроцитов или с помощью градиентного центрифугирования выделяют фракцию мононуклеарных клеток. Суспензию клеток инкубируют в темноте 15–30 мин с соответствующими флюоресцентно мечеными моноклональными АТ. Результаты регистрируют на проточном цитометре или с помощью люминесцентного микроскопа в течение не более 6 ч. Лимфоциты, фиксированные 1% параформальдегидом, можно хранить при +2–8 °С не более 24 ч.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Анализ позволяет оценить количество лимфоцитов в субпопуляции, результаты сопоставляют с нормативными показателями, рассчитывают соотношение Тхелперов и Тцитотоксических лимфоцитов (иммунорегуляторный индекс), содержание активированных Тлимфоцитов и др. Определение процентного соотношения Тлимфоцитов, Влимфоцитов и NKклеток используют для характеристики иммунодефицитных и аутоиммунных состояний, опухолевых и вирусных заболеваний. Фенотипирование лимфоцитов применяют для подтверждения диагноза и мониторинга состояния иммунной системы пациентки в процессе лечения. Чувствительность и специфичность метода зависит от качества используемых реагентов.

ФАКТОР, ВЛИЯЮЩИЙ НА РЕЗУЛЬТАТ

Результат зависит от времени, прошедшего с момента взятия крови. Необходимо проводить исследование в течение 6 ч после взятия крови с гепарином, при фиксации клеток — в течение 24 ч.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ МЕТОД

Используемый ранее метод розеткообразования с эритроцитами не считают современным.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОСНОВНЫХ КЛАССОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ МЕТОДОМ PАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ

СИНОНИМЫ

Определение содержания иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) по Манчини.

ОБОСНОВАНИЕ

Количественное определение сывороточных иммуноглобулинов — один из основных тестов в оценке гуморального звена иммунитета. Концентрация сывороточных иммуноглобулинов отражает функциональное состояние Вклеточного звена иммунитета.

ЦЕЛЬ

Оценка содержания основных классов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) в сыворотке крови.

ПОКАЗАНИЯ

Метод используют для оценки состояния гуморального звена иммунитета, что имеет большое значение для диагностики и прогнозирования тяжести некоторых заболеваний, особенно у иммунокомпрометированных пациентов.

ПОДГОТОВКА

Взятие венозной крови для получения сыворотки.

МЕТОДИКА

Исследуемую сыворотку помещают в лунки агарового геля, который содержит АТ к иммуноглобулинам одного из классов IgG, IgA или IgM в известной концентрации. Иммуноглобулины, диффундирующие из лунок в агар, при взаимодействии с соответствующими АТ образуют кольца преципитации, размер которых прямо пропорционален содержанию иммуноглобулина.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Содержание основных классов иммуноглобулинов в образцах сыворотки крови сопоставляют с нормативными показателями. Чувствительность и специфичность зависят от качества используемых реагентов.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

• Повторное замораживание и оттаивание исследуемых образцов.
• Бактериальное загрязнение.
• Нарушения условий хранения образцов (оптимальная температура хранения сыворотки — 4 °С, для длительного хранения используют температуру –20 °С).

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Иммуноферментный анализ, турбодиметрическое исследование.

МЕТОД ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

СИНОНИМЫ

Оценка продукции активных форм кислорода фагоцитирующими клетками крови.

ОБОСНОВАНИЕ

Центральное место в антимикробной активности фагоцитирующих клеток периферической крови занимает кислородный, или респираторный, «взрыв», вследствие чего генерируются активные формы кислорода в системе НАДФНоксидазы. В оценке кислородного «взрыва» наиболее широко используют методы измерения генерируемых во внеклеточную среду супероксидного аниона или перекиси водорода по их способности окислять соответствующий субстрат (люцигенин или люминол) в люминесцирующий метаболит.

ЦЕЛЬ

Оценка спонтанной и индуцированной продукции активных форм кислорода лейкоцитами крови.

ПОКАЗАНИЯ

Метод эффективен для оценки функционального состояния фагоцитов периферической крови (гранулоцитов и моноцитов), его используют для прогнозирования тяжести заболевания и контроля эффективности терапии при воспалительных процессах.

ПОДГОТОВКА

Кровь, взятую из вены в пробирки с гепарином (2 Ед/мл), разводят раствором Хенкса без кальция в пропорции 1:1, сохраняют в течение 1 ч при 4 °С.

МЕТОДИКА

Продукцию активных форм кислорода оценивают по люминолзависимой хемилюминесценции с помощью хемилюминометра. Разведённую кровь добавляют в ячейки для измерений, содержащие среду Хенкса с добавлением 1 мМ кальция и раствор люминола. Проводят измерение спонтанной хемилюминесценции и хемилюминесценции, активированной опсонизированным зимозаном. Результаты измерения регистрируют непрерывно в виде кинетической кривой. Интенсивность хемилюминесцентного ответа оценивают по максимальному значению на кинетической кривой.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

В результате анализа получают показатели спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, рассчитывают индекс активации (отношение индуцированной к спонтанной реакции), сопоставляют их с нормативными показателями. Чувствительность и специфичность зависят от качества используемых реагентов.

ФАКТОР, ВЛИЯЮЩИЙ НА РЕЗУЛЬТАТ

На результат влияет длительность интервала времени, прошедшего с момента взятия крови. Исследование проводят не позднее чем через 4 ч после взятия крови.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

• Применение теста восстановления нитросинего тетразолия.
• Оценка активных форм кислорода методом проточной цитометрии.

ОЦЕНКА ИНТЕРФЕРОНОВОГО СТАТУСА

ОБОСНОВАНИЕ

ИФН — биологически активные белки или гликопротеиды, синтезируемые клеткой в процессе защитной реакции на чужеродные Аг, представляют собой первую линию защиты против вирусов, принимают участие в стимуляции фагоцитоза, усиливают естественную цитотоксическую активность, оказывают антипролиферативное действие на нормальные и опухолевые клетки. Определение интерферонового статуса — один из тестов оценки иммунореактивности организма.

ЦЕЛЬ

Определение содержания общей фракции сывороточных ИФН, уровня спонтанной и индуцированной in vitro продукции

ИФНα и ИФНγ.

ПОКАЗАНИЯ

Метод используют для оценки функционального состояния лейкоцитов периферической крови, применяют для прогнозирования тяжести заболевания и для контроля эффективности терапии при острых и хронических вирусных инфекциях, аллергических и аутоиммунных заболеваниях, при разработке индивидуальных схем лечения препаратами ИФН и его индукторами.

ПОДГОТОВКА

Взятие венозной крови стерильным одноразовым шприцем в объёме 2 мл в стерильную пробирку с крышкой, содержащую гепарин (2 Ед/мл).

МЕТОДИКА

Тестирование проводят в стерильных 96луночных круглодонных планшетах в трёх повторах. Клетки инкубируют при 37 °С без индукторов, с вирусом болезни Ньюкасла для индукции ИФНα, с фитогемагглютинином Р для индукции ИФНγ. Оставшуюся кровь центрифугируют и используют для определения сывороточного ИФН. Титрование ИФН проводят в 96луночных плоскодонных планшетах с диплоидной культурой фибробластов человека М19. В качестве тествируса используют вирус мышиного энцефаломиокардита. За единицу активности ИФН принимают величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя клеток на 50% (Е/мл).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Повышение титров сывороточного ИФН может свидетельствовать об острой стадии заболевания. Существует прямая связь между показателями ИФНα и ИФНγ и тяжестью заболевания, а также обратная связь с количеством сывороточного ИФН. Снижение продукции ИФНα и ИФНγ указывает на дефект системы ИФН (врождённый или приобретённый); это показание для ИФНстимулирующей терапии.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

• Продолжительность интервала времени, прошедшего с момента взятия крови (не более 4 ч).
• Нарушение стерильности.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

• Иммуноферментный метод.
• Внутриклеточное окрашивание цитокинов в стимулированных клетках, регистрация результатов с помощью проточной цитофлюориметрии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ

СИНОНИМЫ

Определение содержания цитокинов в крови, цитокиновый статус.

ОБОСНОВАНИЕ

Цитокины — медиаторы взаимодействия иммунокомпетентных клеток, регулируют процессы их пролиферации и дифференцировки, обеспечивая нормальное функционирование иммунной системы. Цитокины синтезируются клетками иммунной системы после их активации чужеродными или собственными модифицированными Аг. Определённые провоспалительные цитокины, такие как ИЛ1β, ИЛ6, фактор некроза опухолиα, обеспечивают формирование очага воспаления, и их концентрация в сыворотке крови отражает степень воспалительного процесса. Противовоспалительные цитокины (типичный представитель — ИЛ10) блокируют активность Тлимфоцитов, моноцитов/макрофагов и синтез этими клетками провоспалительных цитокинов. Цитокины участвуют в патогенезе некоторых заболеваний, и определение цитокинового профиля может способствовать уточнению диагноза или стадии заболевания.

ЦЕЛЬ

Измерение содержания определённых цитокинов в сыворотке крови для уточнения диагноза или стадии заболевания.

ПОКАЗАНИЯ

Острые и хронические воспалительные, гиперпластические и опухолевые процессы в органах женской репродуктивной системы.

ПОДГОТОВКА

Взятие крови до приёма пищи.

МЕТОДИКА

Иммуноферментный метод определения Аг (в данном случае цитокинов) в сыворотке крови с использованием различных систем детекции.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Показатели содержания цитокинов в сыворотке крови здоровых женщин не должны превышать 50 пг/мл. Результат исследования может служить дополнительным показателем при диагностике и контроле эффективности лечения женского бесплодия, ВЗОМТ, эндометриоза. Чувствительность и специфичность метода зависят от качества используемых реагентов.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

• Продукты лизиса эритроцитов в исследуемой сыворотке.
• Срок хранения. Следует хранить сыворотки при 4 °С не более 6 ч, при замораживании до –40 °С — до 6 мес.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

• Тестирование биологической активности цитокинов.
• Внутриклеточное окрашивание цитокинов в стимулированных клетках и использование проточной цитофлюориметрии.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИФОСФОЛИПИДНЫХ АНТИТЕЛ К КАРДИОЛИПИНУ, ФОСФАТИДИЛСЕРИНУ, Β2ГЛИКОПРОТЕИНУ, АННЕКСИНУ, ПРОТРОМБИНУ

СИНОНИМЫ

Иммуноферментный анализ для определения антифосфолипидных АТ (IgG, IgM, IgА).

ОБОСНОВАНИЕ

АТ, направленные против фосфолипидов и фосфолипидсвязывающих белков, могут ассоциироваться с эндометриозом, бесплодием неясного генеза, неудачными попытками ЭКО и ПЭ в полость матки.

ЦЕЛЬ

Тест предназначен для количественного определения АТ к фосфолипидам и фосфолипидсвязывающим белкам в сыворотке крови.

ПОКАЗАНИЯ

Рекомендуют для включения в обследование женщин с бесплодием неясного генеза, при эндометриозе и подготовке к ЭКО, ПЭ и беременности.

ПОДГОТОВКА

Все реагенты и исследуемый материал перед использованием выдерживают при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

МЕТОДИКА

Количественный непрямой твёрдофазный иммуноферментный анализ. АТ из исследуемого материала и стандартов связываются с фосфолипидами и фосфолипидсвязывающими белками, иммобилизованными на поверхности лунок планшета. Это можно обнаружить с помощью конъюгата поликлональных АТ против иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена по изменению окрашивания субстратнохромогенного раствора. Оптическую плотность измеряют на фотометре при длине волны 450 нм, рассчитывают средние значения оптической плотности для стандартов, контролей и образцов, с помощью калибровочной кривой по значению оптической плотности определяют соответствующую концентрацию АТ в Ед/мл.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Нормальный диапазон концентраций:

• АТ к кардиолипину: 0–10 Ед/мл;
• АТ к фосфатидилсерину: 0–10 Ед/мл;
• АТ к β2гликопротеину: 0–5 Ед/мл;
• АТ к аннексину: 0–5 Ед/мл;
• АТ к протромбину: 0–10 Ед/мл.

Чувствительность и специфичность: метод специфичен для АТ к соответствующим фосфолипидам и фосфолипидсвязывающим белкам. Перекрестных реакций с АТ к ДНК или другими сифилисспецифичными АТ не отмечено. Нижняя граница определения АТ классов IgG и IgМ составляет 0,5 Ед/мл.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

• Гемолиз.
• Гиперлипидемия.
• Повторное замораживание и оттаивание исследуемых сывороток.
• Бактериальное загрязнение.
• Изменение концентрации исследуемых образцов.
• Нарушения условий хранения сывороток.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОВАРИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

СИНОНИМЫ

Иммуноферментный анализ для определения антиовариальных АТ (IgG, IgM, IgА).

ОБОСНОВАНИЕ

АТ, направленные против Аг яичников, могут вызывать бесплодие у женщин.

ЦЕЛЬ

Тест предназначен для определения АТ, направленных против тканей яичника человека, в сыворотке крови, в цервикальной слизи, маточном секрете и фолликулярной жидкости.

ПОКАЗАНИЯ

Метод рекомендован для включения в план обследования женщин с бесплодием неясного генеза, с первичной яичниковой недостаточностью.

ПОДГОТОВКА

Все реагенты и исследуемый материал перед использованием выдерживают при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

МЕТОДИКА

Тест представляет собой количественный твёрдофазный иммуноферментный анализ (принцип метода аналогичен иммуноферментному анализу для определения антифосфолипидных АТ).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Нормальный диапазон концентраций: 0–10 Ед/мл.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

Гемолиз.

• Повторное замораживание и оттаивание исследуемых образцов.
• Нарушение требований к процедуре взятия цервикальной слизи, маточной и фолликулярной жидкости.
• Нарушение условий хранения образцов.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

СИНОНИМЫ

Тесты для обнаружения АТ к Аг ЦМВ, ВИЧ, ВПГ; хламидий или микоплазм.

ОБОСНОВАНИЕ

Большинство урогенитальных инфекций имеют хроническое течение, поэтому диагностическое значение имеет не только факт обнаружения АТ против данного возбудителя, но и величина их титра, а также класс (IgM, IgА или IgG).

ЦЕЛЬ

Тесты предназначены для количественного определения АТ к Аг ЦМВ, ВИЧ, ВПГ; хламидий или микоплазм.

ПОКАЗАНИЯ

Метод рекомендован для включения в план обследования пациентов с симптомами воспалительных урогенитальных заболеваний, при подготовке женщин к беременности.

ПОДГОТОВКА

Взятие крови из вены и получение сыворотки.

МЕТОДИКА

Тест представляет собой количественный твёрдофазный иммуноферментный анализ.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Обнаружение IgGАТ служит показателем ранее перенесённого заболевания. По существенному изменению титра АТ при повторном исследовании (с 7–14дневным интервалом) можно судить о стадии заболевания. Обнаружение IgMАТ свидетельствует о недавнем инфицировании или об активном процессе, повышение их содержания происходит при реактивации или реинфицировании. IgА обнаруживают при остром или подостром процессе. Чувствительность составляет 97–98%, специфичность варьирует от 80 до 95%.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Радиоиммунный метод.

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ 2 И 9 (ММП2 И ММП9) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (ЗИМОГРАФИЯ)

СИНОНИМЫ

Метод вертикального субстратного электрофореза.

ОБОСНОВАНИЕ

Экспрессия ММП2 и ММП9 в тканях отражает происходящие в них процессы тканевого ремоделирования как в норме (менструация, овуляция, имплантация), так и при патологии (воспалительные и гиперпластические процессы, фиброзы). Тканевые ММП2 и ММП9 проникают в кровь в концентрациях, пропорциональных их экспрессии в тканях. Измерение их концентрации в сыворотке крови даёт информацию о состоянии тканевой реконструкции и позволяет оценить динамику проявлений патологического процесса и эффективности лечения.

ЦЕЛЬ

Диагностика воспалительных и гиперпластических процессов в органах женской репродуктивной системы и мониторинг течения и эффективности лечения.

ПОКАЗАНИЯ

Воспалительные и гиперпластические процессы в органах женской репродуктивной системы, в частности хронический эндометрит, гиперпластические процессы в эндометрии, эндометриоз.

ПОДГОТОВКА

Из венозной крови пациента отделяют сыворотку и подвергают её исследованию или хранят при температуре –20 °С до последующего исследования.

МЕТОДИКА

Образцы сывороток наносят на полиакриламидный гель, содержащий субстрат для ММП2 и ММП9, белки сыворотки разделяют под действием электрического тока. Далее гель инкубируют, при этом находящиеся в нем ММГ2 и ММГ9 протеолитически разрушают субстрат. После специфического окрашивания обнаруживают полосы геля, не содержащие субстрат. Эти полосы соответствуют находящимся в этих участках ММП2 и ММП9. Интенсивность окрашивания полос пропорциональна содержанию ММП2 и ММП9.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Результаты интерпретируют полуколичественно в сравнении с образцами от здоровых субъектов, в баллах или процентах от интенсивности окраски контрольных полос. Чувствительность, по данным разных исследований, колеблется от 80 до 95,3%, специфичность — от 52 до 75%.